Polysciences 24765-1試劑

一、貼壁細胞轉染：Polysciences 24765-1試劑

以293T細胞為(wei) 例，需要精確控製轉染條件以確保*高效率。以下是具體(ti) 步驟：

細胞準備：

使用膠原酶處理細胞並計數。在6孔板中以每孔2×106細胞接種。每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS 培養(yang) 基和1 mL的細胞懸液，置於(yu) 37℃，5%CO2培養(yang) 箱培養(yang) 24 h。24 h後,移除之前培養(yang) 基，每孔加入2 mL新鮮的DMEM/F12+5%FBS。

轉染過程：

1.檢查細胞匯合度，達到70%-80%時開始轉染。

2.分別用兩(liang) 份100 µL無血清培養(yang) 基稀釋DNA，使DNA終濃度為(wei) 1 µg/ml（DNA/總培養(yang) 體(ti) 積）和適當比例的適量Polysciences 24765-1。DNA:PEI 的比例要依據自己實驗摸索最適比例。

3.將稀釋的Polysciences 24765-1轉染試劑與(yu) 質粒（總體(ti) 積200 µL）輕輕混勻，室溫孵育30 分鍾。

4.PEI-DNA 複合物滴加到細胞培養(yang) 板每個(ge) 孔中，輕搖混勻。注意輕輕沿著孔板邊緣滴入，以免破壞細胞的粘附性。

5.將培養(yang) 板放入37℃，5%CO2培養(yang) 箱培養(yang) 中培養(yang) 24 h。

結果觀察：

在24小時後使用熒光顯微鏡觀察轉染效果，超過80%的293T 細胞在轉染後的24 h可以觀察到綠色熒光。

二、懸浮細胞轉染：Polysciences 24765-1試劑

懸浮細胞轉染步驟略有不同，小規模轉染時，用新鮮的培養(yang) 基重懸浮，使細胞密度達到 1×106cells/mL，如需大規模轉染細胞密度要到達2-3×106cellsml/mL。

以293F細胞為(wei) 例：

細胞準備：

傳(chuan) 代接種於(yu) 20 mL 懸浮細胞生長培養(yang) 基中(36.5℃，120 rpm，5%CO2 )培養(yang) 細胞至1×106 cells/mL的密度，旋緊瓶口放入搖床，2~4 小時後可以進行轉染。

轉染過程：

1.用1 mL無血清培養(yang) 基稀釋適量的DNA，使DNA 終濃度為(wei) 1 µg/ml，混勻並靜置5 min。

2.用1 mLOptiPRO

SFM(無血清培養(yang) 基)稀釋適當比例的PEI 40000，混勻並靜置10 min。

3.將稀釋的24765-1轉染試劑與(yu) 質粒輕輕混勻，室溫孵育30分鍾。

4.將PEI-DNA 轉染複合物逐滴加入到細胞培養(yang) 液中，搖勻後旋緊瓶口放回搖床（36.5℃，5%CO2，120 rpm）。

5.基因表達可在24-72小時後檢測，時間取決(jue) 於(yu) 細胞係和轉基因。